欢迎大家订阅电转染小课堂，本期我们首先将介绍Chlamydomonas reinhardtii（莱茵衣藻）模型系统，之后使用ECM 830和ECM630仪器推荐的方案来实现外源DNA对Chlamydomonas reinhardtii的电转化。最后将传统玻璃珠转化和电穿孔法进行比较。
Chlamydomonas reinhardtii是研究基本生物学结构和过程的优选模型系统
Chlamydomonas具有两条鞭毛，其结构和功能与其他生物的纤毛相似。这些鞭毛可以分离出来用于生化和分子分析，并且已经作为模型系统用于研究纤毛的生物发生和鞭毛内运输（IFT）。
Chlamydomonas可用于研究光合作用。它可以在简单的盐介质上生长，利用光合作用获得能量，或者在完全黑暗的环境中生长，乙酸盐作为其替代碳源。
C． reinhardtii以单倍体营养状态存在，或在不利的环境条件下，两种交配类型可能融合并形成二倍体合子孢子。当条件改善时，二倍体合子发生减数分裂并释放四个单倍体细胞，从而恢复营养生命周期。
C． reinhardtii的核，叶绿体和线粒体基因组的完整序列已被测序和定位。
这些特征可用于正向和反向遗传筛选技术。
衣藻资源中心提供了野生型和突变型培养物及试剂的储存库。
电穿孔是引入外源DNA而无需去除衣藻细胞壁的有效和方便的方法。
高效方波电穿孔方案
在液体TAP培养基中培养细胞，使其细胞密度达到1至2 x 10 7cells／ ml。
将细胞原液接种到新鲜的液体TAP培养基中，使其浓度为1 x 10 6cells／ ml，并在连续光照下生长18至20 h，直到细胞密度达到4 x 10 6cells／ ml。
在室温下，将细胞以1250 g离心5 min，洗涤，之后用含有60 mM山梨糖醇的预冷TAP培养基重悬，然后将混合物置于冰上10 min。
将250 ul细胞悬液（或5 x 10 7cells）放入预先冷却的4 mm电极杯中，并加入100 ng所需的外源DNA。
使用方波发生器（例如ECM 830或Gemini X2）进行电穿孔，使用以下电穿孔参数：500 V，4 ms脉冲持续时间，6至7个脉冲，100 ms脉冲间隔时间。
电穿孔后，将电极杯立即放在冰上放置10 min，然后将细胞悬浮液转移到装有10 ml TAP培养基的50 ml锥形离心管中，在昏暗的光线下缓慢摇动过夜。
根据需要，用适当的选择培养基平板细胞。
预期的转化效率是 每ug外源DNA 2－6 x 10 3转化子。
详情请参见Wang L等［1］方法。
指数衰减波电穿孔方案
如方波电穿孔方案所述，准备电穿孔前的细胞。
使用具有指数衰减波形的发生器（例如ECM 630或Gemini X2）进行电穿孔，使用以下电穿孔参数：800 V，1575Ω，50 ?F。
所需脉冲长度为10至14 ms；高于或低于此脉冲长度范围可能会降低转化效率。
当与上述高效方波电穿孔并行测试时，指数衰减波方法产生的效率约为方波效率的50％。
详情请参见Wang L等 ［2］ 方法。
与其他衣藻转化方法的比较
玻璃珠转化［3，4］法是利用玻璃珠的搅拌来引入外源DNA。该方法不需要专用设备，但是在玻璃珠搅拌之前，需要特殊操作去除细胞壁。与上述高效方波电穿孔方法比较时，玻璃珠法约为方波法效率的20％。
另一种类型的电穿孔器（衰减方波脉冲发生器NEPA21）进行电穿孔的好处是不需要去除细胞壁。据报道，使用这种类型的电穿孔器进行转化可产生每ug DNA 0．4－3 x 10 3转化子［5］。但是该方法需要相对大量的外源DNA（每个反应400 ?g）。
相比之下，使用ECM 830和ECM 630等发生器进行高效方波电穿孔和优化的指数衰减波电穿孔，每ug外源DNA可获得高达6 x 10 3转化子的转化效率，不需要去除细胞壁，并且每个转化反应只需要100 ?g外源DNA。
Reference：
［1］． Wang， L．， et al． （2019） Rapid and high efficiency transformation of Chlamydomonas reinhardtii by square－wave electroporation． Biosci Rep 39 （1）： BSR20181210．
［2］． Wang， L．， et al． （2013） Flagellar regeneration requires cytoplasmic microtubule depolymerization and kinesin－13． J． Cell Sci． 126， 1531–1540．
［3］． Kindle， K．L． （1990） High－frequency nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii． Proc． Natl． Acad． Sci． USA 87， 1228–1232．
［4］． Nelson J．A． and Lefebvre P．A． （1995） Transformation of Chlamydomonas reinhardtii． Methods Cell Biol． 47， 513–51．
［5］． Yamano T．， Iguchi H． and Fukuzawa H． （2013） Rapid transformation of Chlamydomonas reinhardtii without cell－wall removal． J． Biosci． Bioeng． 115， 691–694．
自从1938年BTX推出第一台商用电穿孔仪以来，BTX一直处于电穿孔技术的最前沿，一直致力于为各种细胞和组织类型提供完整的转染解决方案，包括真核生物，原核生物，体内组织，卵内，子宫内，贴壁和悬浮培养，植物细胞，皮肤和肌肉免疫。除电穿孔仪外，BTX还为各种应用提供和研发专业的电极。
本文地址： https://www.xsyiq.com/2348.html
网站内容如侵犯了您的权益，请联系我们删除。
